Jesteś tu:
 Strona główna
>
Dla lekarzy
>
Diabetologia od A do Z
>
Oznaczanie hemoglobiny glikowanej w monitorowaniu leczenia cukrzycy
Powrót
Oznaczanie hemoglobiny glikowanej w monitorowaniu leczenia cukrzycy
Dr n. med. Bogdan Solnica
Katedra Biochemii Klinicznej, Collegium Medium, Uniwersytet Jagielloński, Kraków
Kierownik: prof. dr hab. Jerzy Wacław Naskalski
Glikacja jest to samorzutna, zachodząca bez udziału enzymów, reakcja grupy aldehydowej cząsteczki monosacharydu, najczęściej glukozy, z wolnymi grupami aminowymi różnych białek [1].
W przebiegu glikacji wyróżnia się dwa etapy:
1. odwracalna reakcja pomiędzy wolną grupą aldehydową glukozy i grupą aminową białka, której produktem jest aldimina (tzw. zasada Schiffa),
2. nieodwracalne wewnątrzcząsteczkowe przegrupowanie (reakcja Amadori) z wytworzeniem ketoaminy (rys. 1).


 
Ketoaminowa forma białka glikowanego jest połączeniem trwałym i pozostaje aż do rozpadu cząsteczki. Glikacji ulegają wszystkie białka, których cząsteczki zawierają wolne grupy aminowe. Wśród białek krwi występują glikowane formy hemoglobiny, albuminy, lipoprotein i białek układu krzepnięcia. Glikacji ulegają też białka strukturalne, w tym kolagen, oraz białka wewnątrzkomórkowe. Glikacja, powodując zmianę struktury i funkcji wielu białek, odgrywa istotną rolę w patogenezie przewlekłych powikłań cukrzycy.
Ilość powstających produktów glikacji białek zależy od stężenia substratów i lokalnych zmian pH. Ponieważ stężenia białek osocza i hemoglobiny są zwykle stałe, nasilenie glikacji tych białek jest wynikiem współdziałania dwóch czynników: średniego stężenia glukozy oraz czasu, w jakim białko było eksponowane na kontakt z cząsteczkami glukozy. Zależność pomiędzy stężeniem glukozy, a zawartością białek glikowanych stała się podstawą do zastosowania ich w monitorowaniu leczenia cukrzycy jako retrospektywnych wskaźników glikemii. W tym celu oznacza się hemoglobinę glikowaną oraz albuminę glikowaną (fruktozaminę).
Hemoglobina glikowana (glikohemoglobina, GHB, HbA1) składa się z kilku frakcji różniących się lokalizacją glikowanej grupy aminowej oraz rodzajem reagującego z nią monosacharydu. Nieglikowana hemoglobina jest oznaczana jako HbA0, natomiast jej forma glikowana (HbA1) obejmje następujące frakcje [1]:
  • HbA1a– produkt glikacji łańcucha ß HbA1
  • HbA1a1– produkt glikacji przez fruktozo-1,6-difosforan
  • HbA1a2– produkt glikacji przez glukozo-6-fosforan
  • HbA1b– produkt glikacji przez nieznany monosacharyd
  • HbA1c– produkt glikacji N-końcowej waliny łańcucha(ów) ß przez D-glukozę.
Największą frakcję glikohemoglobiny, stanowiącą 75–80% jest HbA1c(A1c). Ta właśnie frakcja hemoglobiny glikowanej jest powszechnie stosowana w diagnostyce jako retrospektywny wskaźnik glikemii i w oznaczeniach diabetologicznych. Przy przeciętnym okresie przeżycia erytrocytów równym około 120 dni, odsetek GHB odzwierciedla średnie stężenie glukozy we krwi na 10–17 tygodni przed oznaczeniem. Ze względu na ciągły obrót erytrocytów i hemoglobiny większy wpływ na zawartość GHB ma średnia glikemia w ostatnich 4–5 tygodniach przed oznaczeniem. Przyjmuje się, że około 50% aktualnej zawartości HbA1c odzwierciedla stężenia glukozy we krwi w ciągu poprzednich 30 dni, 40% – w ciągu poprzednich 31–90 dni, a 10% – na 91–120 dni przed wykonaniem badania.
Na podstawie wyników badań eksperymentalnych i klinicznych stworzono wzory i nomogramy służące do przeliczania odsetka HbA1cna średnie stężenie glukozy w osoczu (tabela, rys. 2). Pewnym utrudnieniem w rozpowszechnieniu tego rodzaju przeliczeń jest brak, jak dotychczas, jednolitego systemu standaryzcji oznaczeń hemoglobiny glikowanej.



 
 


Wykorzystanie oznaczeń HbA1c w monitorowaniu leczenia cukrzycy rozpowszechniło się po ogłoszeniu w latach 90. wyników badań Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) oraz United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS), w których wykazano, że odsetek HbA1cjest nie tylko retrospektywnym wskaźnikiem wyrównania metabolicznego cukrzycy, lecz również niezależnym czynnikiem ryzyka rozwoju jej przewlekłych powikłań. Zgodnie z rekomendacjami towarzystw diabetologicznych, w tym Polskiego Towarzystwa Diabetologicznego, oznaczenia HbA1cpowinny być wykonywane u każdego chorego na cukrzycę w chwili rozpoznania choroby i następnie co 3 miesiące, a jedynie w przypadku stabilnie przebiegającej, dobrze wyrównanej metabolicznie choroby – co pół roku [2, 3]. Docelowa wartość odsetka HbA1c u chorego leczonego na cukrzycę wynosi, zgodnie z różnymi rekomendacjami, 6–7% (przy oznaczaniu metodą standaryzowaną wg NGSP – patrz niżej) [2, 3, 4]. Należy jednak podkreślić, że HbA1c nie może zastąpić oznaczeń glikemii w monitorowaniu leczenia cukrzycy. Odsetek HbA1c jest retrospektywnym wskaźnikiem średniej glikemii, nie odzwierciedla natomiast jej okołodobowych wahań. Innymi słowy, prawidłowa wartość HbA1cbez kontroli glikemii nie może w każdym przypadku świadczyć o wyrównaniu metabolicznym cukrzycy.
Ketoaminowa forma HbA1cjest stabilnym chemicznie połączeniem, wobec czego oznaczanie jej nie ma szczególnych wymogów przedanalitycznych. Materiałem do badania jest pełna krew żylna pobrana na EDTA lub heparynę, albo krew włośniczkowa pobrana na heparynę. Pacjent nie musi być na czczo i nie wymaga żadnego przygotowania przed pobraniem krwi. Materiał nie powinien być przechowywany dłużej niż 2–3 dni ze względu na postępującą glikację hemoglobiny in vitro, szczególnie w warunkach hiperglikemii oraz powstawanie połączeń hemoglobiny z glutationem, które mogą zawyżać wyniki oznaczeń. Niezależny wpływ na zawartość glikohemoglobiny lub zakłócający oznaczenia mogą mieć liczne czynniki przedanalityczne. W niedokrwistościach hemolitycznych przebiegających ze skróceniem przeżycia erytrocytów obserwuje się obniżenie zawartości HbA1. Z drugiej strony, zmniejszenie szybkości przemian hemoglobiny, np. w niedokrwistościach niedoborowych, powoduje przedłużenie procesu glikacji i wzrost zawartości HbA1. Nietrwały prekursor glikohemoglobiny – aldimina, nazywana pre-HbA1, stanowiąca u osób zdrowych 5–8% całkowitej ilości HbA1, a u chorych na cukrzycę do 30%, może być oznaczana niektórymi metodami łącznie z końcową ketoaminową formą HbA1, powodując zawyżenie wyników. Na wyniki oznaczeń HbA1c różnorodny wpływ może mieć zwiększona zawartość hemoglobiny płodowej (HbF) lub występowanie genetycznych wariantów hemoglobiny, jak HbS czy HbC. Chemiczna modyfikacja cząsteczek hemoglobiny w takich stanach jak mocznica, alkoholizm i zażywanie dużych dawek salicylanów może być również przyczyną fałszywie zawyżonych wyników oznaczeń HbA1 [1].
Wyniki oznaczeń GHB przedstawia się w postaci odsetka stężenia hemoglobiny całkowitej, stąd konieczne jest jednoczesne, niezależne oznaczanie HbA i HbA1. Hemoglobinę glikowaną oznacza się za pomocą różnych technik chromatograficznych i metod immunochemicznych. Wśród metod chromatograficznych stosowana jest chromatografia jonowymienna i chromatografia powinowactwa.
Chromatografia jonowymienna jest metodą rozdziału frakcji hemoglobiny w oparciu o ładunek cząsteczek, z wykorzystaniem kationowych żywic jonowymiennych. Związanie wolnych grup aminowych z cząsteczkami glukozy powoduje, że glikohemoglobina ma w środowisku kolumny chromatograficznej mniejszy ładunek ujemny od HbA0. Metoda ta jest dostępna w postaci niskociśnieniowej oraz wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC). Jonowymienną HPLC stosowano do oznaczania HbA1c w badaniach DCCT i UKPDS, co istotnie przyczyniło się do jej rozpowszechnienia.
W chromatografii powinowactwa wykorzystuje się pochodną kwasu borowego związaną z podłożem wypełniającym kolumnę. Reagujące z nią cząsteczki glikohemoglobiny zostają związane kowalencyjnie przez wytworzenie pierścieniowego połączenia z udziałem atomu boru. Po przeprowadzeniu dysocjacji połączenia glikohemoglobiny następuje jej elucja i pomiar zawartości w zebranej frakcji. Metoda ta również występuje w postaci niskociśnieniowej i wysokociśnieniowej. W chromatografii powinowactwa nie obserwuje się interferencji ze strony labilnej aldiminowej postaci HbA1 oraz odmian hemoglobiny: HbF, HbC i HbS. Należy pamiętać, że przy użyciu tej metody oznaczana jest całkowita HbA1, w związku z czym w oparciu o wyniki oznaczenia HbA1 automatycznie wyliczany jest „ekwiwalent HbA1c”.
W metodach immunochemicznych wykorzystuje się monoklonalne przeciwciała przeciw oczyszczonej chromatograficznie HbA1c. Wiążą się one z epitopami obejmującymi N-końcowe fragmenty łańcucha ß HbA1c. Najszerzej stosowane są metody immunoturbidymetryczne z wykorzystaniem powszechnie dostępnych w laboratoriach analizatorów biochemicznych.
Stosowanie do oznaczania hemoglobiny glikowanej różnorodnych metod analitycznych i technik pomiarowych stwarza problem porównywalności uzyskiwanych wyników. W związku z tym, w wielu krajach stworzono narodowe programy standaryzacji i kontroli jakości oznaczeń glikohemoglobiny. Takim programem o zasięgu międzynarodowym jest zainicjowany w 1996 r. w USA Narodowy Program Standaryzacji Glikohemoglobiny (National Glycohemoglobin Standardization Program, NGSP). W programie tym za referencyjną metodę oznaczania glikohemoglobiny przyjęto jonowymienną HPLC [5]. NGSP ma charakter programu certyfikującego. Aktualnie certyfikat NGSP ma ponad 60 metod oznaczania GHB i około 40 laboratoriów. Od kilku lat podejmowane są działania mające na celu stworzenie jednolitego międzynarodowego systemu standaryzacji oznaczeń HbA1c. Koncepcja takiego systemu została stworzona przez grupę roboczą International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) ds. standaryzacji oznaczeń hemoglobiny glikowanej. Grupa ta wprowadziła definicję HbA1c jako hemoglobiny z nieodwracalnie przyłączoną cząsteczką D-glukozy do jednej lub obu N-końcowych cząsteczek waliny łańcuchów ß. Jako pierwotny materiał referencyjny służący do kalibracji metody referencyjnej zastosowano mieszaninę czystej HbA1c i czystej HbA0. Opracowano dwie referencyjne metody oznaczania HbA1c. Są to metody dwuetapowe. W pierwszym etapie swoista endoproteinaza odszczepia od cząsteczek hemoglobiny N-końcowe heksapeptydy łańcuchów ß. Następnie glikowane i nieglikowane heksapeptydy są rozdzielane przy użyciu HPLC i oznaczane ilościowo, co umożliwia uzyskanie wyniku w postaci odsetkowej zawartości HbA1c [6]. Wymagające kosztownej aparatury metody referencyjne mają służyć do kalibracji metod oznaczania HbA1c rutynowo stosowanych w laboratoriach. Ze względu na większą swoistość analityczną metody IFCC daje ona wyniki niższe w porównaniu z metodami certyfikowanymi w NGSP. Wyniki uzyskane przy użyciu odrębnie standaryzowanych metod można przeliczać korzystając z empirycznie wyprowadzonego wzoru:

 

Inaczej wyrażana zależność między średnim stężeniem glukozy w osoczu, a odsetkiem HbA1c (tabela) będzie wiązała się z koniecznością przyjęcia nowych wartości docelowych określających wyrównanie metaboliczne cukrzycy.
Aktualnie trwają prace nad zastosowaniem systemu IFCC w międzynarodowej standaryzacji oznaczeń HbA1c. Zgodnie ze stanowiskiem grupy roboczej trzech towarzystw diabetologicznych: American Diabetes Association (ADA), European Association for the Study of Diabetes (EASD) i International Diabetes Federation (IDF) pierwotny materiał referencyjny i metody referencyjne IFCC mają stanowić nowy międzynarodowy standard kalibracji metod oznaczania HbA1c dokonywanej przez producentów oraz podstawę certyfikacji metod i laboratoriów [8]. Do chwili zakończenia związanych z tym prac zaleca się utrzymanie kalibracji i sposobu wyrażania wyników zgodnie ze standardem NGSP.

Powrót
Do góry
Piśmiennictwo
1. Niederau C.M., Reinauer H. Glycohemoglobins. w: Thomas L. (red.): Clinical Laboratory Diagnostics Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgeselschaft mbH, Frankfurt/Mein1998, 142-148.
2. American Diabetes Association Position Statements. Tests of Glycemia in Diabetes. Diabetes Care 2004;27:S91-S93.
3. Polskie Towarzystwo Diabetologiczne. Zalecenia kliniczne dotyczące postępowania u chorych na cukrzycę 2006. Stanowisko Polskiego Towarzystwa Diabetologicznego. Diabetologia Praktyczna 2006;7: Supl. A.
4. Sacks D.B., Bruns D.E., Goldstein D.E., Maclaren N.K., McDonald J.M., Parrott M. Guidelines and Recommendations for Laboratory Analysis in the Diagnosis and Management of Diabetes Mellitus. Clin Chem 2002;48: 436-472.
5. Little R.R., Rohlfing C.L., Wiedmeyer H.M., Myers G.L., Sacks D.B., Goldstein D.E. The National Glycohemoglobin Standardization Program: A Five-Year Progress Report. Clin Chem 2001; 47: 1985 - 1992.
6. International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) Scientific Division Working Group on HbA1c Standardisation and Network of Reference Laboratories for HbA1c. Approved IFCC Reference Method for the Measurement of HbA1c in Human Blood. Clin Chem Lab Med 2002; 40(1):78–89.
7. Rohlfing C.L., Wiedmeyer H., Little R.R., England J.D., Tennill A., Goldstein D.E. Defining the Relationship Between Plasma Glucose and HbA1c: Analysis of glucose profiles and HbA1c in the Diabetes Control and Complications Trial. Diabetes Care 2002;25: 275-278.
8. Sacks D.B. and for the ADA/EASD/IDF Working Group of the HbA1c. Global Harmonization of Hemoglobin A1c. Clin Chem 2005; 51: 681 - 683.

Powrót
Do góryDrukuj
Słowa kluczowe:

hemoglobina glikowana HbA1c
diabeTECH
DiabetologiaOnline.pl
Nota prawnaPolityka prywatnościRedakcja serwisuKontakt z redakcjąMapa serwisuZgłoś uwagi